問(wèn)答題

我們實(shí)驗(yàn)室研究生做了一個(gè)如下的實(shí)驗(yàn)：將pdc基因（丙酮酸脫羧酶）克隆到pUC18載體中，以便在E.coli TOP10中表達(dá)，這個(gè)pdc基因兩側(cè)具有BamHI的位點(diǎn)，因此計(jì)劃將它從BamHI的位點(diǎn)插入載體中。實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)中進(jìn)行：載體用BamHI切割后，立即用堿性磷酸酶處理，接著將處理過(guò)的載體同用BamHI切割的pdc基因混合，加入T4連接酶進(jìn)行溫育，連接后，將DNA同處理過(guò)的可以接受外源DNA的E.coli TOP10感受態(tài)細(xì)胞混合。最后將混合物涂布在加有氨芐青霉素、IPTG和x-gal固體培養(yǎng)基的平板上。 
實(shí)驗(yàn)中同時(shí)設(shè)置了4個(gè)對(duì)照： 
對(duì)照1：將未同任何載體接觸過(guò)的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上。 對(duì)照2：將未切割載體轉(zhuǎn)化過(guò)的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上。 
對(duì)照3：將經(jīng)切割（但未用堿性磷酸酶處理）并用T4連接酶連接（但沒(méi)有pdc基因）的載體轉(zhuǎn)化過(guò)的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上。 
對(duì)照4：將經(jīng)切割（并用堿性磷酸酶處理過(guò)）并用T4連接酶連接（但沒(méi)有pdc基因）的載體轉(zhuǎn)化過(guò)的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上。 
在進(jìn)行第一次實(shí)驗(yàn)時(shí)，感受態(tài)細(xì)胞不是自己制備的，結(jié)果，在所有的平板上都長(zhǎng)出了多到無(wú)法計(jì)數(shù)的菌落（見(jiàn)下表1）。在第二次實(shí)驗(yàn)中，自己制備感受態(tài)細(xì)胞，但這一次，所有的平板上都沒(méi)菌落生長(zhǎng)（見(jiàn)下表1）。接著又進(jìn)行了第三次實(shí)驗(yàn)，這次得到了轉(zhuǎn)化子（見(jiàn)下表1）。從實(shí)驗(yàn)平板上挑出12個(gè)菌落，分離質(zhì)粒DNA，并用BamHI進(jìn)行切割，其中9個(gè)克隆產(chǎn)生大小同載體pUC18一樣的單一的一條帶，另3個(gè)克隆中切出一個(gè)pdc基因，實(shí)驗(yàn)終于獲得成功。

對(duì)照3和4各有什么作用？

參考答案： 對(duì)照3是檢查切割載體的末端是否預(yù)期的一樣，以及連接酶是否具有活性。限制性內(nèi)切酶的制備物（或是所用的緩沖液）偶爾會(huì)污染外切...