問答題影響酶切反應(yīng)的因素及產(chǎn)生酶切星號活性的分析。

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5.問答題

打算將一個(gè) cDNA 克隆到一個(gè)表達(dá)載體，以便在 E．coli 中大量制備相應(yīng)的蛋白質(zhì)。這個(gè)cDNA 的兩側(cè)具有 BamHI的位點(diǎn)，因此計(jì)劃將它從 BamHI的位點(diǎn)插入載體中。實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格地按照克隆手冊中的方法進(jìn)行：載體用 BamHI切割以后，立即用堿性磷酸酶處理除去 5’磷酸；接著將處理過的載體同用 BamHI切割的 cDNA 片段混合，加入 DNA連接酶后進(jìn)行溫育，連接之后，將 DNA 同已處理過的可以接受 DNA的細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞混合。最后，將混合物涂布在加有抗生素固體培養(yǎng)基的平板上。由于載體上帶有抗生素的抗性基因，所以，轉(zhuǎn)化的細(xì)菌能夠存活。實(shí)驗(yàn)中同時(shí)設(shè)置了 4 個(gè)對照： 
對照1：   將未同任何載體接觸過的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上；       
對照2：   將未切割載體轉(zhuǎn)化過的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上；  
對照3：   將經(jīng)切割（但未用堿性磷酸酶處理）并用連接酶連接（但沒有cDNA片段）的載體轉(zhuǎn)化過的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上；  
對照4：   將經(jīng)切割（并用堿性磷酸酶處理過）并用 DNA連接酶連接（但沒有cDNA片段）的載體轉(zhuǎn)化過的細(xì)
菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上。  
     在進(jìn)行第一次實(shí)驗(yàn)時(shí)，感受態(tài)細(xì)胞不是自己制備的，結(jié)果，在所有的平板上都長出了多到無法計(jì)數(shù)的菌落（表 2）。在第二次實(shí)驗(yàn)中，自己制備感受態(tài)細(xì)胞，但這一次，所有的平板上都沒有菌落生長（表 2）。接著又進(jìn)行了第三次實(shí)驗(yàn)，這次得到了轉(zhuǎn)化子（表 2）。從實(shí)驗(yàn)平板上挑出 12 個(gè)菌落，分離了質(zhì)粒 DNA，并用 BamHI進(jìn)行切割，其中 9個(gè)克隆產(chǎn)生大小同載體一樣的單一的一條帶，另三個(gè)克隆中切出一個(gè)cDNA 片段，實(shí)驗(yàn)終于獲得成功。

為什么要用堿性磷酸酶處理載體？